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[器材和試劑]●T4DNA連接酶及10×緩沖液（NEB）●酚/氯仿（Sigma）●100%和70%乙醇，-20℃保存●消化的載體和scFv文庫●TE（10mmol/LTrispH8，lmmol/LEDTA）[方法]1.如下所述，配制兩個100ul連接混合液，其中1個用于VH-VκscFv文庫，另1個用于Vu-VλscFv文庫，并設置兩個對照反應。對照可以確定未切的載體有多少（對照2），以及確定無插入序列時有多少重新連接的載體（對照1）。要保持恰當的比例，所獲得的克隆數（對于相...
[方法]1．將大腸桿菌TG1種到基本培養瓊脂板，37℃過夜。2．將基本培養瓊脂板上的大腸桿菌TGl再接種到含有15m12XTY培養基的100ml形瓶中。37℃振蕩培養過夜。3．用5ml夜培養的TGl接種到兩個含500m12×Y培養基的2L有擋板錐形瓶中。在搖床中培養約1．5小時，直到A600接近0．5。4．將菌液轉移4個預冷離心瓶中（約250ml/瓶）。平衡后，置于冰上20分鐘。5．以3000g，4℃離心15分鐘。使用前預冷所有轉頭。6，棄去上清，并以起始體積的冰冷lmmol...
[器材和試劑]●用于細菌培養的96孔圓底微量滴定板（Nunc，目錄號62162）●含100ug/ml氨芐青霉素和0．1％葡萄糖的2XTY培養基（2×TY/amp/0．1％glu）●含100ug/ml氨芐青霉素和3mmol/LIPTG的2XTY培養基（2×TY/amp/glu/IPTG）（參見實驗方案13．10）●噬菌體樣品[方法]1．用96孔無菌轉移設備或移液器從主板中，每孔取2ul；而后轉移至1個每孔含有100ul2×TY/amp/0.1％glu的無菌96孔微量滴定板中。2...
[方法]1．配制PCR“主混合液”，每克隆20ulPCR混合液，包含：●水，15．5ul●10XRT緩沖液，2．0ul●5mmol／LdNTP，1．0ul●5，引物，1．0ul●3，引物，1．0ul●Taq聚合酶，0.2ul如果PCR緩沖液中不含Mg2+，這應加至終濃度為1．5mmol／L。也可以使用與DNA聚合酶配套供應的PCR試劑。2．取20fLl主混合液加到0．5m1管內，或加入96孔PCR微孔板孔內。3．用l根牙簽輕輕接觸單個克隆并在PCR反應液中轉動，注意不要轉移太...
[器材和試劑]●PCR試劑和設備●WinardPCR純化試劑盒（Promega）●定制的DNA引物●VL—NotI引物（5，—GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGCACGGTCAGCTTGGTCCCTCCGCCGAACACCCAACC—3’）●LMB3引物●用于scFv基因文庫限制性消化的試劑和設備●已擴增的scFv基因文庫DNA[方法]1．配制4個50ulPCR反應混合液，包含：●去離子水，35．5ul●20×dNTP（每種5mmol/L），2．5u...
[器材和試劑]●去離子水（millipore）●T4DNA連接酶和10×連接酶緩沖液（NEB）●16℃水浴●消化的scFv文庫DNA●pHENlDNA，用NcoI和NotI消化（100ng／ul）●電感受態大腸桿菌TGl細胞（Strataeene）●用于將scFv文庫電轉化到大腸桿菌TGl株的試劑和設備[方法]1．配制1個50ul連接混合液，包含：●10×連接緩沖液，5uI●水，16ul●NcoI和NotI消化的pHENl（100g／ul），20ul●VcoI和NotI消化的...
1．多樣化的噬菌體抗體丈庫中制備噬菌體抗體。2．根據廠家說明，對抗原進行生物素化。3．選擇前，在1個1．5m1微量離心管中．用2％MPBS1m1封閉150ul鏈霉親和素磁珠，室溫1小時。用磁性試管架將碰珠吸向一側。棄去緩沖液。4．用2％MPBS封閉3個1．5m1微量離心管，室溫1小時；而后，棄去封閉緩沖液。以3個不同濃度將士物素化抗原（總共3管）與溶于2％MPDS（終濃度）的1m1噬茼體樣品（大約1012c{u／m1）進行孵育，室溫振蕩l小時。對于*輪選擇，抗原濃度應分別為K...
選擇3～5輪后，隨機挑取克隆加入96孔微量滴定板中并誘導表達可溶性scFv。然后，在包被有相關抗原的96孔微量滴定板中，用ELISA分析含有可溶性scFv的細菌上清。此過程可以識別出那些結合了抗原的scFv。但即便采用上述嚴謹性選擇后，ELISA陽性克隆中僅有部分克隆的親和力比野生型高。ELISA信號強度不能很好地顯示哪個克隆具有較低的Ka值，而且更為普遍的是它與scFv表達水平相關。因此，這就需要一種篩選ELISA陽性克隆的技術，能識別出具有較低Ka值的克隆。競爭性或抑制性...
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