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噬菌體展示文庫體外篩選的通用步驟

更新時間:2013-03-14點擊次數:3273

1.通過腹腔注射濃度為1.25%(w/v)的阿佛丁來麻醉小鼠。
2.打開胸腔并暴露心臟。
3.用10ml的DMEM或PBS來灌注小鼠。
4.連同一個或多個對照器官一起,取出要研究的器官和組織,并將其置于一個直徑為30m的細胞培養皿中。
5.用無菌刀片將每個器官或組織都切碎。
6.將切碎的器官或組織放到2.2m1的無菌塑料管中,并加入1.8m1 0.5mg/m1的膠原酶。混勻并在37℃搖瓶孵育30分鐘。在37℃培養時,持續搖動樣品。
7.以1500r/min的速率短暫離心細胞懸液5分鐘,并棄去上清。
8.將每份用膠原酶處理過的器官或組織放到70txm的尼龍細胞濾網上,并把懸液過濾到50m1錐形瓶中。加入10ml含1%BSA的DMEM到細胞濾網頂部,讓細胞都過濾到50m1錐形瓶中,加兩次。這使得細胞懸液的總量為20ml。在臺式臨床離心機中,以1500r/min離心5分鐘沉淀細胞。丟棄上清,并用20m1含1%BSA的DMEM洗滌沉淀兩次。
9.第6~8步也可用DAKO’s MediMachine制備來自器官或組織的單細胞懸液。將每份器官或組織分別放入50/1m的Medicon中,并置于MediMachine中打散2分鐘。用1ml的LHer注射器抽出Medicon中的細胞懸液,并通過?0gm的Filcon把單細胞懸液過濾到14m1的錐形瓶中。將1m1含1%BSA的DMEM加到MediCOn的小室中,并重復打散和抽濾的步驟。將整個循環重復3次。在臺式臨床離心機中,細胞懸液以1500r/min離心5分鐘。棄去上清,并保留細胞沉淀。
10.用1ml含1%BSA的DMEM重懸來自第8步或第9步的細胞,并在光學倒置顯微鏡下用Neubauer-ruled血球計數板來計數。
11.將每份器官或組織的細胞懸液都取出一部分,使得每個1.7ml塑料管中細胞總量約為1×107個。
12.將細胞在冰上放置5分鐘。
13.把109~1010TU或pfu的噬菌體加到細胞中,并加入含1%BSA的DMEM使其總體積為0.5~1ml。根據需要可以采用體積更大的噬菌體。
14.將噬菌體和細胞一起在4℃孵育30分鐘至過夜。低溫會阻止對所有已結合的噬菌體的內吞作用。 當檢測單克隆時,我們采用較短的時間,而當篩選不同的初的文庫時,則采用較長的時間。
15.細胞懸液以5000r/min的速率短暫離心2~3分鐘,并棄去上清。
16.用含1%BSA的DMEM重懸細胞,輕輕吹打。以5000r/min的速率短暫離心細胞2—3分鐘,并棄去上清。再重復此操作3次,共洗滌4次。zui終,第5次用含1%BSA的DMEM重懸細胞沉淀,將其轉入一個新的2.2m1無菌塑料管中。以5000r/min短暫離心細胞2~3分鐘,并棄去上清。

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