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從外周血淋巴細胞(PBls)中分離RNA

更新時間:2013-03-09點擊次數:1414

[方法]
1.收集新鮮人血液并立即用Ficoll分離白細胞。
2.用冰冷PBS洗滌外周血淋巴細胞3次。
3.在50ml塑料離心管中收集外周血淋巴細胞,并加入7ml裂解緩沖液(可溶解達到5×108個外周血淋巴細胞),然后劇烈渦旋振蕩以溶解細胞。
4.加入7體積(49m1)4m01/L氯化鋰,4℃孵育15~20小時(過夜)。
5.將懸液轉移到30mlCorex管內,在吊桶式轉頭內4℃離心2小時,6500r/min。
6.棄去上清,并用Kimwipe擦拭試管口。用3mol/L氯化鋰(大約15ml)重懸,收集沉淀.將沉淀重懸液離心,6500r/min 1小時。
7.棄去上清,用2m1RNA溶解液溶解沉淀。在-20℃下,*冷凍懸液。
8.復溶懸液,每10分鐘渦旋20秒,共45分鐘。
9.用等體積酚抽提1次,并用等體積氯仿抽提1次。
10.加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉,pH 4.8和2體積一20℃乙醇。*混合溶液,并在-20℃下孵育過夜。
11.在吊桶式轉頭內離心RNA,12000r/min 30分鐘。用0.2m1DEPC處理水重懸沉淀。將溶解的DNA轉移至1.5m1微量離心管內,并加入1/10體積3mol/L乙酸鈉,pH 4.8和2體積一20℃乙醇,重新沉淀。并以乙醇沉淀物形式保存RNA,直至準備使用時。

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